Все формулы РФ

Химия / Химическая кинетика

Бесконкурентное ингибирование фермента: скорость и Km

При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается с комплексом фермента и субстрата. В простой обратимой модели кажущиеся Vmax и Km уменьшаются в одинаковое число раз, определяемое концентрацией ингибитора.

Опубликовано: Обновлено:

Химическая кинетикаФерментативная кинетикаСтраницы с задачами и решениямиЕсть историческая справка

Формула

$$v_0=\frac{V_{max}[S]_0}{K_m+\alpha^{\prime}[S]_0},\quad \alpha^{\prime}=1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}$$
Схема Где связывается ингибитор
Бесконкурентное ингибированиеE + SESE + PESI+ I

В модели I связывается с комплексом ES; ESI не образует продукт.

Обозначения

$v₀$
начальная скорость, моль/(л·с)
$Vmax$
предельная скорость без ингибитора, моль/(л·с)
$[S]₀$
начальная концентрация субстрата, моль/л
$Km$
константа Михаэлиса без ингибитора, моль/л
$[I]$
свободная концентрация ингибитора, моль/л
$K′i$
константа диссоциации ингибитора от ES, моль/л
$α′$
коэффициент 1+[I]/K′i, безразмерная

Условия применения

Рассматривается начальная скорость односубстратной реакции при постоянных температуре, pH и концентрации активного фермента. Ингибитор обратимо связывается только с ES; комплекс ESI не даёт продукта. Свободная концентрация ингибитора известна и приблизительно постоянна.

Ограничения

При заметном связывании ингибитора его общая концентрация может отличаться от свободной. Необратимое ингибирование, связывание с E или превращение ESI требует иной модели. Параллельность нескольких экспериментальных прямых — признак согласия с моделью, а не доказательство механизма.

Подробное объяснение

В схеме бесконкурентного ингибирования свободный фермент E связывает субстрат S, образуя ES. Ингибитор I связывается с ES, но в принятой модели не связывается со свободным E. Получившийся ESI не образует продукт и временно выводит часть фермента из продуктивного цикла.

Коэффициент α′=1+[I]/K′i равен единице без ингибитора и растёт с его свободной концентрацией. Деление числителя и знаменателя исходной скорости на α′ приводит к форме Михаэлиса — Ментен с Vmax,app=Vmax/α′ и Km,app=Km/α′. Уменьшение кажущегося Km само по себе не означает, что константа диссоциации субстрата стала меньше: это параметр модели скорости.

Поскольку оба параметра уменьшаются одинаково, их отношение Km,app/Vmax,app не меняется. Поэтому идеальные прямые Лайнуивера — Бёрка для разных концентраций ингибитора параллельны, хотя их вертикальные пересечения различаются. Реальный разброс измерений и ошибки преобразования не позволяют установить точную параллельность по двум точкам.

При увеличении [S]₀ скорость приближается к Vmax/α′, а не к исходному Vmax. Добавление субстрата не устраняет подавление: образование ES одновременно создаёт мишень для ингибитора. Это отличается от идеального конкурентного ингибирования, при котором предел скорости при больших [S]₀ сохраняется.

Для расчёта нужно использовать [I] и K′i в одинаковых единицах концентрации. Если известна только общая концентрация ингибитора, её применимость как приближения к свободной следует проверить отдельно, особенно когда фермента или других связывающих компонентов много.

Как пользоваться формулой

  1. Проверьте схему: ингибитор связывается с комплексом ES обратимо, а комплекс ESI не образует продукта.
  2. Приведите свободную концентрацию ингибитора и K′i к одинаковым единицам и рассчитайте α′=1+[I]/K′i.
  3. Для кажущихся параметров разделите исходные Vmax и Km на α′, сохраняя их единицы.
  4. Подставьте концентрацию субстрата в исходную формулу скорости или в форму с кажущимися параметрами.
  5. Проверьте предел при нулевом ингибиторе и сопоставьте полученную скорость с пониженным предельным значением.

Историческая справка

Михаэлис и Ментен в 1913 году исследовали зависимость ферментной скорости от субстрата и учитывали влияние продукта в опытах с инвертазой. Это создало экспериментальную основу для дальнейшего сравнения моделей связывания и подавления скорости.

В статье 1934 года Лайнуивер и Бёрк использовали преобразованные графики для анализа кинетических моделей, в том числе различных вариантов ингибирования. Прямая в двойных обратных координатах позволяла сопоставлять наклоны и пересечения в условиях, когда численная обработка была трудоёмкой.

Современное учебное описание различает связывание ингибитора только со свободным ферментом, только с ES или с обоими состояниями. Бесконкурентный случай выделяют по модели связывания с ES и одинаковому изменению кажущихся Vmax и Km. Сам графический рисунок не заменяет независимой проверки механизма и анализа исходных скоростей.

Историческая линия формулы

Бесконкурентное ингибирование — один из модельных случаев обратимого ингибирования, развившихся в рамках ферментной кинетики. Работа Лайнуивера и Бёрка 1934 года важна для графического анализа; нет оснований считать приведённую современную запись отдельным открытием одного автора.

Пример

В модели фермента без ингибитора Vmax=100 мкмоль/(л·с), Km=4 ммоль/л. Свободная концентрация ингибитора [I]=2 ммоль/л, K′i=2 ммоль/л; субстрата [S]₀=4 ммоль/л. Найдём начальную скорость. Сначала α′=1+2/2=2. Подстановка даёт v₀=100·4/(4+2·4)=400/12≈33,33 мкмоль/(л·с). Кажущиеся параметры равны Vmax,app=50 мкмоль/(л·с) и Km,app=2 ммоль/л. Проверка другой формой: v₀=50·4/(2+4)=200/6≈33,33 мкмоль/(л·с). Без ингибитора при той же концентрации скорость 100·4/(4+4)=50 мкмоль/(л·с), поэтому снижение согласуется с моделью. Оценка относится к свободной концентрации I и указанным условиям.

Частая ошибка

Не используйте коэффициент α′ как множитель только при Km: здесь он стоит при концентрации субстрата. Не считайте кажущееся снижение Km прямым доказательством усиления связывания. Не подставляйте общую концентрацию ингибитора вместо свободной без проверки. Не ожидайте восстановления исходного Vmax при избытке субстрата.

Практика

Задачи с решением

Кажущиеся параметры

Условие. Vmax=90 мкмоль/(л·с), Km=6 ммоль/л, [I]=4 ммоль/л, K′i=2 ммоль/л. Найдите кажущиеся параметры.

Решение. α′=1+4/2=3. Vmax,app=90/3=30 мкмоль/(л·с), Km,app=6/3=2 ммоль/л.

Ответ. Vmax,app=30 мкмоль/(л·с); Km,app=2 ммоль/л.

Ингибитор для уменьшения предела

Условие. Какую свободную концентрацию ингибитора требует уменьшение Vmax в четыре раза при K′i=0,5 ммоль/л?

Решение. α′=4; 1+[I]/0,5=4, отсюда [I]=3·0,5=1,5 ммоль/л.

Ответ. 1,5 ммоль/л.

Дополнительные источники

  • https://goldbook.iupac.org/terms/view/11546/plain
  • https://chem.libretexts.org/Courses/Pacific_Union_College/Kinetics/09%3A_Enzyme_Kinetics/9.05%3A_Enzyme_Inhibition
  • https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3381512/
  • https://garfield.library.upenn.edu/classics1985/A1985ACS2100002.pdf

Связанные формулы

Химия

Конкурентное ингибирование: кажущийся Kₘ и неизменный Vmax

$v=\frac{V_{max}[S]}{\alpha K_m+[S]},\qquad \alpha=1+\frac{[I]}{K_i}$

В простой модели обратимого конкурентного ингибирования субстрат и ингибитор взаимно исключают связывание со свободным ферментом. Кажущийся Kₘ возрастает вα раз, а предельная скорость Vmax сохраняется.

Химия

Уравнение Лайнуивера — Бёрка для ферментной кинетики

$\frac1{v_0}=\frac{K_m}{V_{max}}\frac1{[S]_0}+\frac1{V_{max}}$

Уравнение Лайнуивера — Бёрка преобразует гиперболическую зависимость начальной скорости ферментной реакции от концентрации субстрата в прямую в двойных обратных координатах. По её наклону и пересечению с осью находят параметры модели.