Все формулы РФ

Химия / Химическая кинетика

Смешанное ингибирование фермента: параметры α и α′

Смешанное ингибирование описывает обратимое связывание ингибитора и со свободным ферментом E, и с комплексом ES, но с разными константами. Параметры α и α′ меняют соответственно член с Km и член с [S], поэтому вид кривой нельзя свести к чисто конкурентному или чисто неконкурентному случаю.

Опубликовано: Обновлено:

Химическая кинетикаФерментативная кинетикаРучной расчетСтраницы с задачами и решениямиЕсть историческая справка

Формула

$$v_0=\frac{V_{max}[S]}{\alpha K_m+\alpha^{\prime}[S]},\quad\alpha=1+\frac{[I]}{K_i},\quad\alpha^{\prime}=1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}$$
Схема Смешанное ингибирование снижает предельную скорость
036912020406080100v₀, мкМ/мин[S], мМБез ингибитора[I] = 2 мМ

У кривых без ингибитора и при 2 мМ ингибитора разные уровни насыщения. В точке [S]=6 мМ скорости равны 60 и 45 мкМ/мин.

Обозначения

$v₀$
начальная скорость, единица скорости
$Vmax$
скорость без ингибитора при насыщении, единица скорости
$[S]$
начальная концентрация субстрата, моль·л⁻¹
$[I]$
концентрация свободного ингибитора в модели, моль·л⁻¹
Ki, Ki′
параметры связывания I с E и ES, моль·л⁻¹

Условия применения

Используют начальные скорости при постоянных pH, температуре и количестве активного фермента. Ингибитор связывается обратимо с E и ES; концентрация свободного I приближённо равна введённой только когда связывание не истощает его заметно. Субстрат находится в избытке над ферментом, продукт ещё не накопился. α и α′ относятся к одной определённой концентрации I и одному механистическому варианту опыта. Комплекс ESI в этой модели каталитически неактивен.

Ограничения

Модель не доказывает механизм только формой двойного обратного графика: такие графики усиливают ошибку малых скоростей. Она не годится для медленно связывающихся, необратимых, агрегирующихся или многоцентровых ингибиторов без расширения схемы. Ki и Ki′ — параметры модели и не равны IC50 без специальных условий. Если α=α′, это чистый неконкурентный случай с неизменным кажущимся Km.

Подробное объяснение

В смешанной схеме E может связать I до субстрата, а ES — после субстрата. Первый путь уменьшает доступность E и в уравнении умножает Km на α. Второй путь уводит ES в ESI и проявляется множителем α′ при [S]. Поэтому у модели два независимых направления связи, а не один общий «процент ингибирования».

Баланс форм фермента при квазистационарном описании включает E, ES, EI и ESI. Если EI=[E][I]/Ki и ESI=[ES][I]/Ki′, а исходная зависимость [ES]/[E]=[S]/Km сохраняется, из баланса получается v₀=Vmax[S]/(αKm+α′[S]). Это уравнение удобно для подгонки, но само по себе не сообщает молекулярную причину разницы Ki и Ki′.

При [S]→∞ скорость стремится к Vmax/α′. Следовательно, если α′ больше единицы, избыток субстрата не возвращает исходный Vmax. Кажущийся Km равен αKm/α′: он возрастает, когда ингибитор предпочитает свободный E, и может уменьшаться при предпочтении ES. Называть это «изменением сродства» можно лишь осторожно, поскольку Km вообще не всегда является константой диссоциации.

Для достоверного вывода измеряют несколько рядов [S] при нескольких [I] и сравнивают остатки конкурирующей, бесконкурентной и смешанной моделей. Отдельные параметры Ki и Ki′ получают из глобальной нелинейной подгонки, а не из пересечения двух нарисованных прямых.

Как пользоваться формулой

  1. Выберите несколько концентраций I, включая нулевую, и для каждой измерьте начальные скорости на широком диапазоне [S].
  2. Убедитесь, что скорость линейна по времени на интервале отбора и что растворимость I не ограничивает старшие точки.
  3. Для заданного [I] вычислите α и α′ через Ki и Ki′, сохраняя одинаковые единицы концентрации.
  4. Сложите αKm и α′[S] в знаменателе, затем разделите Vmax[S] на эту сумму.
  5. Проверьте предельную оценку Vmax/α′ и не выдавайте кажущийся Km за константу диссоциации без механистических данных.

Историческая справка

Классические схемы обратимого ингибирования стали развиваться вместе с измерениями начальных скоростей в первой половине XX века. Простое конкурентное торможение оказалось недостаточным для ферментов, у которых лиганд связывается и со свободной, и с субстрат-связанной формой. В работах Уильяма Клиленда 1960-х годов систематизировались номенклатура и уравнения ингибирования для реакций с одним и несколькими субстратами.

Смешанная модель стала важна именно как обобщение: конкурентный и бесконкурентный пределы возникают из неё при исключении одного пути, а чистый неконкурентный требует равенства влияний на E и ES. Современные рекомендации по ферментной кинетике сохраняют различие между наблюдаемыми параметрами скорости и гипотезой о связывании. Поэтому исторически α и α′ — язык анализа данных, который должен сопровождаться проверкой механизма, а не ярлык для любого снижения активности.

Историческая линия формулы

Уравнение смешанного ингибирования не принадлежит одному автору. Его современная систематизация связана с развитием стационарной ферментной кинетики и с работами Уильяма В. Клиленда по номенклатуре ингибирования в 1960-х годах. Термины α и α′ описывают модельные множители для двух путей связывания и не являются прямыми измерениями структуры комплекса.

Пример

Пусть Vmax=90 мкМ·мин⁻¹, Km=3,0 мМ, [I]=2,0 мМ, Ki=4,0 мМ, Ki′=8,0 мМ. Тогда α=1+2/4=1,5, α′=1+2/8=1,25. При [S]=6,0 мМ получаем v₀=90·6/(1,5·3+1,25·6)=540/12=45 мкМ·мин⁻¹. Без ингибитора скорость была бы 90·6/(3+6)=60 мкМ·мин⁻¹. При очень большом [S] модель даёт не 90, а 90/1,25=72 мкМ·мин⁻¹. Численная предельная проверка: при [S]=600 мМ расчёт даёт 90·600/(4,5+750)≈71,6 мкМ·мин⁻¹, близко к пределу 72. Единицы согласованы: α и α′ безразмерны, знаменатель измеряется в мМ, поэтому после сокращения остаётся единица скорости.

Частая ошибка

Нельзя подменять смешанное ингибирование чистым неконкурентным, если α и α′ различны. Ошибка — считать, что любой рост кажущегося Km означает конкурентный механизм: α′ тоже влияет на Km,app. Не подставляйте IC50 вместо Ki без вывода для конкретного опыта. Ещё одна ошибка — использовать суммарно добавленный I, хотя при заметном связывании нужен свободный I. И, наконец, не считайте скорость при большом [S] равной Vmax: здесь предел Vmax/α′.

Практика

Задачи с решением

Скорость при смешанном ингибировании

Условие. Vmax=80 мкМ·мин⁻¹, Km=2 мМ, α=2, α′=1,5, [S]=4 мМ. Найдите v₀.

Решение. Знаменатель 2·2+1,5·4=10 мМ, числитель 80·4=320.

Ответ. v₀=32 мкМ·мин⁻¹.

Высокий субстрат

Условие. Для Vmax=75 мкМ·с⁻¹ и α′=1,25 найдите предельную скорость при [S]→∞.

Решение. В пределе член αKm мал по сравнению с α′[S], поэтому v₀→Vmax/α′.

Ответ. 60 мкМ·с⁻¹.

Дополнительные источники

  • https://iubmb.qmul.ac.uk/kinetics/ek4t6.html
  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92001/
  • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14021668/

Связанные формулы

Химия

Субстратное ингибирование фермента: уравнение Холдейна

$v_0=\frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]+[S]^2/K_i},\qquad [S]_{opt}=\sqrt{K_mK_i}$

Уравнение субстратного ингибирования описывает ферментную реакцию, в которой избыток того же субстрата замедляет начальную скорость. В отличие от обычной гиперболы Михаэлиса–Ментен, кривая имеет максимум: после оптимальной концентрации [S] скорость падает.

Химия

Ping-pong Bi–Bi: начальная скорость двухсубстратной реакции

$v_0=\frac{V_{max}[A][B]}{K_B[A]+K_A[B]+[A][B]}$

Формула Ping-pong Bi–Bi задаёт начальную скорость реакции с двумя субстратами A и B, если фермент после первого превращения переходит во временно изменённую форму E′ и только затем связывает B. В такой схеме нет тройного комплекса EAB, а оба субстрата ограничивают скорость.

Химия

Интегральное уравнение Михаэлиса–Ментен для кривой прогресса

$V_{max}t=[S]_0-[S](t)+K_m\ln\frac{[S]_0}{[S](t)}$

Интегральное уравнение связывает время и остаточную концентрацию субстрата во всей кривой прогресса, а не только её начальный наклон. Оно следует из d[S]/dt=−Vmax[S]/(Km+[S]) и полезно, когда [S] заметно убывает во время опыта.

Химия

Конкурентное ингибирование: кажущийся Kₘ и неизменный Vmax

$v=\frac{V_{max}[S]}{\alpha K_m+[S]},\qquad \alpha=1+\frac{[I]}{K_i}$

В простой модели обратимого конкурентного ингибирования субстрат и ингибитор взаимно исключают связывание со свободным ферментом. Кажущийся Kₘ возрастает вα раз, а предельная скорость Vmax сохраняется.

Химия

Бесконкурентное ингибирование фермента: скорость и Km

$v_0=\frac{V_{max}[S]_0}{K_m+\alpha^{\prime}[S]_0},\quad \alpha^{\prime}=1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}$

При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается с комплексом фермента и субстрата. В простой обратимой модели кажущиеся Vmax и Km уменьшаются в одинаковое число раз, определяемое концентрацией ингибитора.

Химия

Чистое неконкурентное ингибирование фермента

$v_0=\frac{V_{max}[S]_0}{(1+[I]/K_i)(K_m+[S]_0)}$

При чистом неконкурентном ингибировании ингибитор одинаково связывается со свободным ферментом и комплексом фермент — субстрат. В простой обратимой модели Vmax уменьшается, а кажущееся Km остаётся прежним.