Химия / Химическая кинетика

Субстратное ингибирование фермента: уравнение Холдейна

Уравнение субстратного ингибирования описывает ферментную реакцию, в которой избыток того же субстрата замедляет начальную скорость. В отличие от обычной гиперболы Михаэлиса–Ментен, кривая имеет максимум: после оптимальной концентрации [S] скорость падает.

Опубликовано: 10 ноября 2026 г.Обновлено: 10 ноября 2026 г.

Формула

v_0=\frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]+[S]^2/K_i},\qquad [S]_{opt}=\sqrt{K_mK_i}

Схема Скорость при избытке субстрата

В примере максимум равен 72 мкМ/мин при 6 мМ. При 18 мМ скорость снижается примерно до 56,84 мкМ/мин.

Обозначения

$v₀$: начальная скорость образования продукта, моль·л⁻¹·с⁻¹ или выбранная единица скорости
$Vmax$: масштаб скорости k_cat[E]_T при данном количестве фермента, та же единица скорости, что v₀
$[S]$: концентрация субстрата в начале измерения, моль·л⁻¹
$Km$: концентрационный параметр K_m модели ингибирования, моль·л⁻¹
$Ki$: параметр связывания второй молекулы субстрата неактивным комплексом ES₂, моль·л⁻¹

Когда применять

Формула нужна, когда измеренные начальные скорости сначала растут с концентрацией субстрата, а затем систематически уменьшаются. По ней рассчитывают скорость при заданном [S], находят концентрацию максимальной скорости и отличают такой механизм от простого насыщения. Модель применяют только к начальному участку опыта, где накопление продукта и изменение концентрации фермента не искажают измерение.

Условия применения

Рассматривается начальная скорость односубстратной ферментативной реакции при постоянных pH, температуре и общем количестве фермента. Субстрат находится в большом избытке над ферментом. Простейшая схема предполагает E+S⇄ES→E+P и дополнительное равновесие ES+S⇄ES₂, причём ES₂ не образует продукт на масштабе измерения. Параметры Km и Ki получают из серии опытов с начальными скоростями, а не переносят автоматически из другого буфера, температуры или варианта фермента. При выводе используются быстрое равновесие связывания или соответствующие стационарные отношения концентраций.

Ограничения

Это не универсальный диагноз по одной точке на нисходящей ветви. Падение скорости может быть вызвано изменением pH, агрегацией, вязкостью, ограничением переноса вещества, ошибкой анализа либо обратной реакцией. Формула не описывает кооперативные ферменты, несколько субстратов, заметное накопление продукта и необратимую инактивацию без отдельной проверки механизма. В общем случае Km здесь является параметром модели; нельзя без доказательства считать его константой диссоциации ES.

Подробное объяснение

При обычной кинетике Михаэлиса–Ментен увеличение [S] лишь заполняет активные центры, и скорость выходит на плато Vmax. При субстратном ингибировании в избытке появляется ещё одно состояние: уже связанный ES присоединяет вторую молекулу субстрата и становится неактивным ES₂. Поэтому субстрат одновременно необходим для катализа и способен уводить фермент из активного комплекса.

Запишем упрощённую схему E+S⇄ES→E+P и ES+S⇄ES₂. Для начальной скорости продуктом и обратной реакцией пренебрегают. В простейшем пределе быстрого равновесия обоих этапов связывания [ES]=[E][S]/Km, а [ES₂]=[ES][S]/Ki. Баланс фермента равен [E]T=[E]+[ES]+[ES₂].

Подстановка этих выражений в баланс даёт [E]T=[E](1+[S]/Km+[S]²/(KmKi)). Скорость v₀=kcat[ES]. После исключения свободного [E] и замены Vmax=kcat[E]T получается v₀=Vmax[S]/(Km+[S]+[S]²/Ki). Квадратичный член в знаменателе — не декоративная поправка: именно он отвечает за спад при больших [S].

Максимум находится дифференцированием по [S]. Производная числителя и знаменателя даёт условие Km−[S]²/Ki=0, следовательно [S]opt=√(KmKi). Если [S] меньше этой величины, скорость растёт; если больше — дальнейшее добавление субстрата уменьшает долю ES и увеличивает долю ES₂.

Все концентрации в знаменателе должны быть в одинаковых единицах. Удобно использовать мМ для [S], Km и Ki: отношение [S]²/Ki тогда тоже выражено в мМ. Значение Vmax сохраняет единицы скорости. Для оценки параметров подгоняют все исходные точки нелинейной моделью; линейное обращение скоростей усиливает шум и не заменяет проверку остатков.

Как пользоваться формулой

Снимите начальные скорости при нескольких концентрациях субстрата, охватывая подъём, максимум и нисходящую часть кривой.
Проверьте, что pH, температура и концентрация фермента одинаковы, а скорости определены на линейных начальных участках.
Выразите [S], Km и Ki в одной концентрационной единице; Vmax и искомая скорость — в одной единице скорости.
Подставьте [S] в знаменатель Km+[S]+[S]²/Ki и разделите Vmax[S] на полученное значение.
Для поиска вершины сначала вычислите √(KmKi), затем отдельно проверьте, что соседние концентрации дают меньшую скорость.
Если данные не показывают явного спада или остатки имеют структуру, не объявляйте Ki найденным без сравнения альтернативных моделей.

Историческая справка

Связь скорости ферментативной реакции с концентрацией субстрата стала количественной после работы Леонор Михаэлиса и Мод Ментен 1913 года о кинетике инвертазы. Их простая схема объясняла насыщение, но не обязана описывать случаи, в которых избыток субстрата образует дополнительный неактивный комплекс. В 1920-е и 1930-е годы развитие представлений о фермент–субстратных комплексах позволило записывать такие расширенные схемы через закон действующих масс.

Дж. Б. С. Холдейн в книге «Enzymes» (1930) разбирал вариант, где к комплексу ES присоединяется вторая молекула субстрата. Для этой схемы получается выражение Vmax/v=1+Km/[S]+[S]/Ki, алгебраически эквивалентное формуле этой страницы. Поэтому в прикладной биокинетике её часто называют уравнением Холдейна, хотя термин и конкретные параметры зависят от принятой схемы.

Позднее кинетические исследования описали конкретные случаи конкурентного действия субстрата и развили номенклатуру ингибирования. Современные рекомендации IUPAC подчёркивают, что классическая Михаэлиса–Ментен относится к начальной скорости при избытке субстрата и к гиперболическому насыщению. Субстратное ингибирование — содержательное расширение этой модели, а не просто «неудачная» гипербола; его параметры имеют смысл только вместе с условиями эксперимента и проверяемой схемой.

Историческая линия формулы

Название «уравнение Холдейна» уместно для простейшей схемы E+S⇄ES→E+P, ES+S⇄ES₂, которую Дж. Б. С. Холдейн обсуждал в книге 1930 года. Нельзя приписывать ему все случаи падения скорости при избытке субстрата: это наблюдаемый кинетический рисунок с несколькими возможными механизмами. Исходная традиция Михаэлиса–Ментен и последующие исследования ингибирования одинаково важны для современной записи.

Пример

В опыте с ферментом получили Vmax=120 мкмоль·л⁻¹·мин⁻¹, Km=2,0 мМ и Ki=18,0 мМ. Найдём концентрацию максимальной начальной скорости и скорость при ней. Все концентрации оставим в мМ: это допустимо, потому что в дроби [S]²/Ki единица снова будет мМ. Оптимум равен [S]opt=√(2,0·18,0)=√36=6,0 мМ. Подставляем: v₀=120·6/(2+6+6²/18)=720/(8+2)=72 мкмоль·л⁻¹·мин⁻¹. При 18 мМ скорость уже меньше: 120·18/(2+18+18²/18)=2160/38≈56,8 мкмоль·л⁻¹·мин⁻¹. Проверка согласуется с механизмом: при 6 мМ второй субстратный комплекс ещё не преобладает, а при 18 мМ добавка [S]²/Ki равна 18 мМ и заметно увеличивает знаменатель. Ответ 72 меньше Vmax=120, что также обязательно для этой модели.

Частая ошибка

Не путайте субстратное ингибирование с конкурентным: здесь роль ингибитора играет сам S, а в знаменателе появляется [S]²/Ki, поэтому избыток S не устраняет торможение. Нельзя подставлять [S] в мМ, а Km или Ki в моль/л: квадрат концентрации делает такую ошибку особенно разрушительной. Не считайте максимум равным Vmax: при конечных Km и Ki доля неактивного ES₂ уже есть. Наконец, спад одной экспериментальной точки не доказывает механизм; нужны повторы на нисходящей ветви и контроль стабильности фермента.

Практика

Задачи с решением

Скорость до максимума

Условие. Для Vmax=100 мкмоль·л⁻¹·мин⁻¹, Km=2,0 мМ, Ki=18,0 мМ найдите v₀ при [S]=3,0 мМ.

Решение. Знаменатель равен 2+3+3²/18=5,5 мМ. Числитель 100·3=300 в согласованных единицах. Делим 300 на 5,5.

Ответ. v₀≈54,5 мкмоль·л⁻¹·мин⁻¹.

Положение и высота максимума

Условие. Пусть Vmax=70 мкмоль·л⁻¹·с⁻¹, Km=0,80 мМ и Ki=20,0 мМ. Найдите [S]opt и v₀ в этой точке.

Решение. [S]opt=√(0,80·20,0)=4,0 мМ. В вершине v₀/Vmax=1/(1+2√(Km/Ki))=1/(1+2√0,04)=1/1,4.

Ответ. [S]opt=4,0 мМ; v₀=50 мкмоль·л⁻¹·с⁻¹.

Дополнительные источники

https://goldbook.iupac.org/terms/view/M03892/pdf
https://iubmb.qmul.ac.uk/kinetics/ek4t6.html
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ja01498a025
https://alameed.edu.iq/DocumentPdf/Library/eBook/2383.pdf

Связанные формулы

Химия

Смешанное ингибирование фермента: параметры α и α′

$v_0=\frac{V_{max}[S]}{\alpha K_m+\alpha^{\prime}[S]},\quad\alpha=1+\frac{[I]}{K_i},\quad\alpha^{\prime}=1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}$

Смешанное ингибирование описывает обратимое связывание ингибитора и со свободным ферментом E, и с комплексом ES, но с разными константами. Параметры α и α′ меняют соответственно член с Km и член с [S], поэтому вид кривой нельзя свести к чисто конкурентному или чисто неконкурентному случаю.

Химия

Ping-pong Bi–Bi: начальная скорость двухсубстратной реакции

$v_0=\frac{V_{max}[A][B]}{K_B[A]+K_A[B]+[A][B]}$

Формула Ping-pong Bi–Bi задаёт начальную скорость реакции с двумя субстратами A и B, если фермент после первого превращения переходит во временно изменённую форму E′ и только затем связывает B. В такой схеме нет тройного комплекса EAB, а оба субстрата ограничивают скорость.

Химия

Интегральное уравнение Михаэлиса–Ментен для кривой прогресса

$V_{max}t=[S]_0-[S](t)+K_m\ln\frac{[S]_0}{[S](t)}$

Интегральное уравнение связывает время и остаточную концентрацию субстрата во всей кривой прогресса, а не только её начальный наклон. Оно следует из d[S]/dt=−Vmax[S]/(Km+[S]) и полезно, когда [S] заметно убывает во время опыта.

Химия

Уравнение Михаэлиса–Ментен для начальной скорости

$v=\frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]}$

Уравнение Михаэлиса–Ментен описывает начальную скорость ферментативной реакции через предельную скорость, концентрацию субстрата и параметр Km.

Химия

Конкурентное ингибирование: кажущийся Kₘ и неизменный Vmax

$v=\frac{V_{max}[S]}{\alpha K_m+[S]},\qquad \alpha=1+\frac{[I]}{K_i}$

В простой модели обратимого конкурентного ингибирования субстрат и ингибитор взаимно исключают связывание со свободным ферментом. Кажущийся Kₘ возрастает вα раз, а предельная скорость Vmax сохраняется.

Химия

Бесконкурентное ингибирование фермента: скорость и Km

$v_0=\frac{V_{max}[S]_0}{K_m+\alpha^{\prime}[S]_0},\quad \alpha^{\prime}=1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}$

При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается с комплексом фермента и субстрата. В простой обратимой модели кажущиеся Vmax и Km уменьшаются в одинаковое число раз, определяемое концентрацией ингибитора.

Химия

Каталитическая константа фермента: расчёт kcat

$k_{cat}=\frac{V_{max}}{[E]_{T}}$

Каталитическая константа kcat — отношение предельной скорости ферментной реакции к общей концентрации активных каталитических центров. Она выражает число оборотов на центр в единицу времени при насыщении субстратом в принятой модели.

Химия

Каталитическая эффективность фермента kcat/Km

$\frac{k_{cat}}{K_m}=\frac{V_{max}}{[E]_T K_m}$

Отношение kcat/Km характеризует начальную скорость ферментной реакции при низкой концентрации субстрата в модели Михаэлиса — Ментен. Оно связывает скорость с концентрациями активных центров и субстрата.